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Quick Cell 外泌體提取試劑盒常見問題回答

更新時間:2018-07-26      點擊次數(shù):3415

1、本試劑盒貨號:D3030L1411如何保存?

    室溫保存,無需低溫保存。

2、本試本劑盒貨號:D3030L1411能否分離純化200-1000nm直徑的囊泡嗎?

    不能,本試劑盒不能用于直徑大于200nm囊泡的分離。

3、本試劑盒貨號:D3030L1411適用于哪些種類樣品中的外泌體提?。?/span>

    除細胞上清液外,本試劑盒還可用于尿液及其他低密度體液(如腦脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等)的外泌體提取。

4、本試劑盒貨號:D3030L1411提取過程會用到哪些儀器和耗材?

    低溫高速離心機、渦旋振蕩器(Vortex)、水浴鍋、移液器、離心管(1.5mL、50mL)。

5、樣品在提取外泌體之前是否可以低溫保存?

     可以。長期請保存于-80℃,無須加凍存液;短期(1-2天內(nèi))則保存于4℃即可。

6、粘度過大的樣品如何處理?

    如果樣品粘度過大時(因細胞分泌物較多所致),可將樣品用1×PBS緩沖液進行等體積稀釋,混勻稀釋后的樣品再使用本試劑盒提取外泌體。

7、培養(yǎng)細胞時,如何去除血清來源的外泌體?

    多數(shù)情況下,細胞在體外培時養(yǎng)需要血清,而血清中一般都含有外泌體,為避免血清對細胞外泌體的污染,可采用以下兩種方法:

(1)  將細胞培養(yǎng)用的血清通過1×105g超速離心10h以去除血清外泌體;

(2)  選擇無血清培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。

8、無外泌體血清培養(yǎng)基(或者無血清培養(yǎng)基)在什么時候使用?

    細胞在正常含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定的時間后,細胞融合度約為60%-70%時,移去原有含血清的培養(yǎng)基,換成新鮮的無外泌體血清培養(yǎng)基(或者無血清培養(yǎng)基),繼續(xù)培養(yǎng)24-48h,細胞融合度達到80%-95%左右時收取上清,該上清液即可用于提取外泌體。

 

9、細胞培養(yǎng)過程中的死細胞是否會影響外泌體的提???

    會的。在收獲細胞時,應(yīng)確定死亡細胞占比不超過5%。細胞凋亡/死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡,它們在外泌體的提取純化過程中會污染活細胞產(chǎn)生的外泌體,同時有可能會堵塞EPF純化柱。

10、準備做細胞外泌體Small RNA的NGS測序,初始樣品量需要準備多少?

    普通腫瘤細胞系推薦使用40mL以上的初始樣品量。由于某些細胞(如懸浮細胞、干細胞、神經(jīng)細胞等)中外泌體含量比較低,建議先通過10kD超濾柱濃縮,準備40mL以上的濃縮液再使用本試劑盒提取外泌體。

11、加了ECS液離心之后無沉淀,這個現(xiàn)象正常嗎?

    由于某些細胞(如懸浮細胞、干細胞、神經(jīng)細胞等)中外泌體含量比較低,加了ECS液離心之后肉眼可能無法觀察到沉淀,在重懸時使用PBS液朝離心管離心外側(cè)的內(nèi)壁反復(fù)吹打洗脫即可(避免劇烈吹打)。針對提取后的外泌體先進行NTA粒徑檢測或BCA蛋白定量檢測,再決定是否進行后繼實驗。

12、在純化過程中,EPF柱為什么會出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象?

      該現(xiàn)象有可能是因為細胞培養(yǎng)時間過長產(chǎn)生很多細胞碎片(樣品離心預(yù)處理時不充分,仍有細胞碎片殘留),建議細胞培養(yǎng)24-48h左右收集上清液。

13、EPF柱是否可以多次使用?

    不能重復(fù)使用。過量的樣品會超出純化柱的使用極限,影響分離效果。

14、外泌體如何保存?

    純化后的外泌體可于4℃保存不超過一周,-80℃條件下可長期保存。

15、如何鑒定提取的外泌體?

    通常使用透射電鏡檢測(形態(tài))、粒徑檢測(大?。estern blot檢測等方法鑒定提取的外泌體。在進行Western blot檢測時,通常檢測外泌體標志蛋白(CD63、CD9、CD81、TSG101等)。

16、提取的外泌體進行Western blot前是否需要加入RIPA試劑裂解?

    需要,一般按照1:1的比例加入RIPA試劑。

17、進行外泌體Western blot鑒定時有無內(nèi)參蛋白可供選擇?

      無,該檢測屬于定性檢測。                              

18、組織細胞外泌體如何提???

    無菌環(huán)境下將組織剪成小塊(越小越好),然后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h;將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中,于4℃以3000g離心20 min去除培養(yǎng)液中雜質(zhì)和細胞碎片,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中;先使用0.45μm濾器過濾上清液,接著使用0.2μm濾器過濾上清液,再按照本試劑盒說明書提取外泌體。

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