注意!使用ecL化學(xué)發(fā)光液一定要明白這幾點(diǎn)
更新時(shí)間:2018-11-22 點(diǎn)擊次數(shù):9034
ecL化學(xué)發(fā)光液的使用方法,執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、洗膜。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。推薦將一抗?jié)舛认♂尩?.5ug/ml(0.05~1ug/ml均可)將二抗?jié)舛认♂尩?.02ug/mL(0.005~0.04ug/mL均可)后1次洗膜的同時(shí),新鮮配制發(fā)光工作液:根據(jù)用量將兩種組份按1:1比例混合均勻,備用。注:1)短時(shí)間暴露于日光燈下不會(huì)損害該工作液,但為獲得佳結(jié)果,將此工作液保存在棕色瓶中,避免暴露于任何強(qiáng)光。
取A液和B液一定要用不同的槍頭,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。用平頭鑷取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液,勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上(推薦150μl發(fā)光液/cm2膜),使之充分接觸。室溫孵育5分鐘,準(zhǔn)備立即壓片曝光。用平頭鑷子夾起膜,膜的下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余的液體,留下少量工作液,不可讓膜*干燥。
在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上,將保鮮膜折起來(lái)*包裹印跡膜,去除氣泡和皺褶,可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi),蛋白條帶面向上。在黑暗中將X感光膠片放置在包裹的保鮮膜上,根據(jù)蛋白濃度曝光適當(dāng)時(shí)間(根據(jù)光強(qiáng)度需摸索曝光時(shí)間,一般30s-2min),顯影沖洗。注:根據(jù)經(jīng)驗(yàn),如果背景過(guò)高,可使用兩張X感光膠片同時(shí)壓片。
ecL化學(xué)發(fā)光液的注意事項(xiàng),步驟1~5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量,將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn),低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光,因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳,可用洗膜緩沖液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL發(fā)光和曝光。由于超敏發(fā)光液極其靈敏,強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000。抗體濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶,導(dǎo)致失敗。某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光,應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。使用肉眼可見(jiàn)的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性,回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3,如必需使用勿超過(guò)0.01%。