2022年7月22日,上海科技大學(xué)生命學(xué)院池天課題組,在線發(fā)表學(xué)術(shù)論文“Large-Scale Multiplexed Mosaic CRISPR Perturbation in the Whole Organism"(最新影響因子:66.850)。
生命學(xué)院池天課題組2016級博士劉波(已畢業(yè))、2018級博士生荊征宇、2019級博士生張校銘、2014級博士陳玉鑫(已畢業(yè))、2015級博士毛少帥(已畢業(yè))為本文共同第一作者。
池天教授為通訊作者。
上??萍即髮W(xué)為第一完成單位。本工作得到孫建龍、林照博、黃行許實驗室的幫助。
文章簡介
本篇文章報道了一種嶄新的小鼠基因打靶技術(shù)iMAP(inducible Mosaic Animal for Perturbation),快速鑒定了90個基因在39種組織的基本功能,構(gòu)建了世界首張小鼠“擾動圖譜"。
早在2001年,國際人類基因組計劃就公布了人類基因組序列。但目前為止,約兩萬個哺乳動物蛋白編碼基因在500多種細(xì)胞中的功能仍鮮為人知。要解碼這些基因的細(xì)胞特異性功能,必須將其分別在各種細(xì)胞中敲除(擾動)再鑒定其細(xì)胞表型,即描繪“擾動圖譜"。但用傳統(tǒng)的基因打靶方法,無法快速有效地描繪擾動圖譜,成為功能基因組學(xué)領(lǐng)域久攻不下的瓶頸。池天課題組的成果為突破上述瓶頸、系統(tǒng)性解碼全部基因在各種細(xì)胞中的功能,邁出了關(guān)鍵一步。
iMAP融合了Cre-loxP和CRISPR-Cas9技術(shù),其核心組成部分是一個轉(zhuǎn)基因序列,它由U6啟動子和下游一串gRNA表達(dá)單位構(gòu)成。轉(zhuǎn)基因通常只表達(dá)第?個sgRNA,而利用藥物(他莫昔芬)激活Cre,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因重組,可使其余的sgRNA也得以表達(dá),但每個細(xì)胞只隨機表達(dá)其中?個。這些sgRNA可在Cas9的幫助下敲除相應(yīng)的靶基因,從而將小鼠轉(zhuǎn)化為嵌合體。利用這種嵌合體,可同時鑒定多個基因分別在多種細(xì)胞里的功能,也可衍生出多種傳統(tǒng)的單基因敲除品系用于后續(xù)實驗。
圖1. iMAP原理
研究團隊首先構(gòu)建了一個iMAP品系,它攜帶61個gRNA 表達(dá)單位,共靶向6個功能已知的標(biāo)志基因。該品系證明了iMAP的魯棒性,包括展示轉(zhuǎn)基因起碼能穩(wěn)定傳13代。隨后構(gòu)建的iMAP品系攜帶100個gRNA表達(dá)單位,靶向90個功能不甚清晰的基因,以此構(gòu)建了一個微型擾動圖譜,揭示了這90個基因分別在39個組織/細(xì)胞中對細(xì)胞存活、擴增、分化的影響。
圖2. 微型擾動圖譜。展示100個sgRNA分別在39個組織/細(xì)胞類型中的豐度
該研究過程中,科研人員使用了李記生物自主研發(fā)的熱門產(chǎn)品:EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(高效) 貨號:AC04L091 / AC04L092
注意:C4058L1090在20年元旦已更換貨號為:AC04L091,質(zhì)量不變。
——以上圖片截自期刊
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